羅丹明B（RB）是一種人工合成染料，常用於紡織業、製藥工業和生物分析化學領域。RB對人和動物的致癌性、生殖發育毒性、神經毒性和慢性毒性已被許多研究證明。然而，由於RB具有鮮豔的顏色特性和較強的染色穩定性，且價格便宜，一些不法商家為了增強和保持食品外觀，吸引消費者，將其非法用於食品中，特別是辣椒粉、辣椒油、醬料等中，給消費者的飲食安全帶來了極大的風險。

　　近年來，一些新的納米材料如熒光微球、量子點，時間分辨熒光微球等逐步應用到免疫層析法中，以提高其檢測靈敏度，其中時間分辨熒光微球是含有大量鑭係熒光材料的功能微球，具有熒光強度大、壽命長、斯托克斯位移大等獨特光學性質，能有效消除基質中各種背景熒光幹擾，與膠體金、普通熒光微球和量子點熒光免疫層析法相比，時間分辨熒光免疫層析（TRFICA）法具有檢出限（LOD）低、線性範圍寬、抗原及抗體用量少、檢測時間短等優勢，目前已成為食品中有害小分子化合物定量分析的一個焦點研究方向，並被廣泛報道，然而其能否應用於RB的檢測目前鮮見相關報道。RB是一種熒光物質，在水溶液中最大發射波長為576 nm，但其熒光壽命極短，不到3 ns，而時間分辨熒光信號的收集時間範圍是400～800 μs，在此範圍內RB產生的熒光已完全衰減，因此，采用TRFICA實現對RB的檢測在理論上是可行的。

　　棗莊學院食品科學與製藥工程學院的王照鵬*、 高馨妍、劉瀟晴 等人結合時間分辨熒光標記技術和側流免疫層析技術，初步探討TRFICA應用於RB檢測的可行性。通過優化熒光探針的標記條件、試紙條包被和反應條件、樣品預處理等，建立調味品中RB的TRFICA方法，旨在為食品中非食用色素的監管提供新的檢測工具。

　　本實驗所構建方法基於競爭性免疫分析原理，樣品溶液中的RB與NC膜上包被的RB-BSA抗原競爭結合探針抗體。如圖2所示，將標記好的探針和樣品溶液加入到微孔中，孵育後用試紙條進行檢測，當樣品溶液無RB時，探針被T線包被的RB-BSA抗原捕獲，在紫外光下可形成明亮的熒光線，此時為陰性；若樣品溶液含有RB時，則與T線上的RB-BSA抗原競爭探針，減少探針與RB-BSA抗原的結合，導致T線的熒光減弱或消失，此時為陽性。樣品溶液中RB越多，T線處的熒光強度越弱。無論樣品中是否含有RB，探針均會與C線預先包被的二抗結合，在紫外光下出現一條熒光線，即質控線

　　影響抗原抗體反應的因素包括抗原和抗體濃度、反應pH值、反應時間等，本研究采用單因素分析法對抗原包被量、探針抗體標記量、試紙條反應pH值等試紙條反應條件進行優化。NC膜上的包被抗原與樣品中目標物分子競爭結合熒光探針上的抗體，抗原包被量過多將抑製探針抗體和樣品中目標物的結合，產生低靈敏度信號。選擇1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL 4 個RB-BSA抗原質量濃度進行優化，如圖3a所示，試紙條包被抗原質量濃度越高，雖然T線熒光強度有所增強，但抑製率也隨之升高，當抗原質量濃度為1.0 mg/mL時，抑製率最低，故作為最佳抗原包被量。

　　探針抗體標記量能顯著影響檢測試紙條熒光信號強度和抑製率。抗體標記量過大將使熒光探針上抗體過飽和，需要更高濃度的RB才能抑製探針和T線抗原的結合，造成檢測靈敏度下降。選擇anti-RB mAb標記量（anti-RB mAb與熒光微球料液比）分別為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL，如圖3b所示，當抗體標記量越大，試紙條T線熒光強度越強，抑製率出現先降低後升高的趨勢。當抗體標記量為0.4 mg/mL熒光微球時，抑製率最低，故作為熒光微球最佳抗體標記量。

　　pH值可誘導抗體分子發生顯著的構象變化，這可能破壞與抗原的互補性，影響抗原抗體結合。對樣品稀釋液的pH值進行優化，如圖3c所示，試紙條在不同pH值條件下T線熒光強度和抑製率均出現明顯差異，當pH值為7.4時，試紙條抑製率最低，故確定的試紙條反應的最佳pH值為7.4。

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　　表麵活性劑在側流免疫層析中能降低表麵張力，促進側向流動過程，並促進免疫探針在試紙條上的擴散，減少非特異性吸附，進而影響試紙條顯色和抑製率。本實驗比較了吐溫-20、吐溫-80、曲拉通X-100和S9 4 種表麵活性劑對試紙條T線顯色和抑製率的影響，如圖3d所示，當使用曲拉通X-100和S9作為表麵活性劑時，試紙條T線顯色較弱且抑製較差，當使用吐溫-20和吐溫-80時，兩者熒光強度相當，但吐溫-20抑製率更低，故選擇吐溫-20作為試紙條反應最佳表麵活性劑。

　　有機溶劑濃度過高可降低抗體生物活性，影響與抗原的結合。因樣品預處理使用的提取劑為體積分數40%乙醇溶液，故需確定試紙條的最高乙醇耐受量，以確定樣品提取液的稀釋倍數。如圖3e所示，當乙醇體積分數為5%～20%時，試紙條的T線顯色和抑製率相差不明顯，當乙醇體積分數達到30%時，試紙條顯色明顯變弱，探針在NC膜底端出現明顯聚集，推測過高的乙醇含量可能影響了探針在NC膜上的遷移，並影響了探針和抗原的結合，造成試紙條顯色減弱和抑製率升高。雖然試紙條最高可耐受體積分數20%乙醇溶液，但乙醇體積分數為10%時，抑製率相對更低，故選擇體積分數10%乙醇溶液作為試紙條反應的最佳乙醇耐受量。

　　熒光探針用量能顯著影響試紙條T線熒光強度，使T/C值改變，進而影響抑製率。如圖3f所示，隨著熒光探針用量的增加，試紙條T線熒光強度逐漸增強，抑製率出現先升高後降低的趨勢。當熒光探針用量為4 μL時，抑製率最低，故選擇4 μL作為試紙條反應的最佳探針用量。

　　試紙條層析時間過短情況下，反應難以達到平衡，影響檢測準確性，層析時間過長，則會降低檢測效率。如圖4所示，隨著反應的進行，C線和T線熒光強度不斷產生變化，T/C值也不斷變化，但反應17 min後，T/C值基本趨於穩定，說明反應達到動態平衡，故確定試紙條的反應時間為17 min。綜合以上條件，能夠確定試紙條的檢測步驟：1）取4 μL熒光探針加入微孔中，加入50 μL 1.3.5節稀釋後的樣品提取液，混勻，室溫孵育3 min；2）取40 μL上述混合物加到試紙條樣品墊上，層析反應17 min後，用熒光免疫分析儀讀數；3）將樣品的T/C值代入標準曲線方程，計算樣品中RB的質量分數。

　　因RB在水和乙醇中具有高溶解性，分別選擇不同體積分數的乙醇溶液作為樣品提取劑。如圖5所示，隨著乙醇體積分數的升高，試紙條抑製率也逐漸升高，乙醇體積分數為40%時抑製率最低，故選擇40%乙醇溶液作為樣品提取劑。

　　在不含RB的辣椒粉、辣椒油和番茄醬空白樣本中添加RB標準品，梯度含量分別為0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/kg，用試紙條進行測試，每個梯度重複3 次，取其平均值，以標準品質量分數的常用對數為橫坐標，以T/C值為縱坐標，建立標準曲線。分別以標準曲線% inhibition concentration，IC10）作為LOD，以IC20～IC80作為其線性範圍，確定本方法對辣椒粉的LOD為1.9 μg/kg，IC50為8.7 μg/kg，線a）；對辣椒油的LOD為0.7 μg/kg，IC50為4.6 μg/kg，線b）；對番茄醬的LOD為1.5 μg/kg，IC50為5.4 μg/kg，線c）。

　　在痕量物質檢測中，為評價方法對目標物檢測的高度特異性和靈敏性，宜采用低濃度目標物和高濃度類似物進行分析。在方法特異性評價中，分別對質量濃度為5 μg/L的RB和質量濃度為1 000 ng/mL的羅丹明110、羅丹明123、羅丹明6G、結晶紫、對位紅、胭脂紅等10 種色素用試紙條進行了檢測，並用樣品稀釋液作陰性對照。如圖7所示，用試紙條檢測高質量濃度的羅丹明110、羅丹明123、羅丹明6G、結晶紫、對位紅、胭脂紅等色素時，其顯色強度及T/C值與陰性對照差異不大，而檢測低質量濃度的RB時其顯色強度及T/C值下降明顯，表明試紙條對於RB有高度特異性，而對其他色素均無明顯反應，說明本方法特異性良好。

　　根據標準曲線方程分別獲得對辣椒粉、辣椒油、番茄醬3 種樣本的線性範圍，在線性範圍內選取高、中、低3 個梯度質量分數，對LC-MS/MS確證過的陰性樣本做添加回收實驗。每個梯度質量分數做6 個重複，計算平均回收率和批內變異，用3 個批次試紙條對同一批樣本進行檢測，計算批間變異。如表1所示，辣椒粉、辣椒油、番茄醬3 種樣本中RB平均添加回收率範圍為87.0%～106.1%，批內變異係數為5.4%～11.2%，批間變異係數為6.4%～11.6%。表明本方法具有較好的準確度和精密度。

　　近年來調味品中RB非法添加報道常見於辣椒及其製品、番茄醬等商品中，本研究選擇辣椒粉、辣椒油和番茄醬3 種調味品作為研究對象，考慮到不同調味品可能產生不同的基質效應，故擬合了不同的標準曲線，分別用於辣椒粉、辣椒油和番茄醬中的RB檢測，從添加回收實驗結果看，方法具有良好的準確度和精密度，表明本方法具有較好的樣本適應性，具有推廣應用到其他類型調味品的潛力。

　　從市場隨機采購辣椒粉、辣椒油和番茄醬樣品各3 份，用LC-MS/MS檢測後均為陰性。在樣品中分別添加RB梯度含量為5、10、20 μg/kg，同時用TRFICA法和LC-MS/MS法進行分析，如圖8所示，兩種方法檢測結果具有高度相關性（R2＝0.941 3），說明本方法檢測結果可靠，可用於調味品中RB的快速篩查。

　　TRFICA與已有檢測方法的比較如表2所示。UPLCMS/MS法等雖然具有較高的靈敏度，但需要大型昂貴儀器和專業技術人員、成本高、檢測時間較長，不宜作為快速篩查和現場檢測方法。紫外-可見分光光度法需要將樣品中RB濃縮後才可實現痕量檢測，靈敏度較低。電化學分析法雖然較為靈敏，但易受樣品中電活性物質幹擾，樣品預處理較為複雜，導致分析時間延長。表麵增強拉曼光譜分析方法雖然檢測快速，但對基底親和力要求高，對基質幹擾敏感，其靈敏度有待進一步提高。ELISA方法雖然靈敏，但需要多次孵育和洗滌，操作過程繁瑣、耗時長，難以滿足快速檢測需求。目前研究報道的免疫層析法主要是膠體金法，該法雖然操作簡單、檢測成本低，但膠體金納米粒子亮度低、靈敏度較差。本研究建立的TRFICA方法具有LOD低、檢測時間短、樣品預處理簡單、回收率高的特點，無論在靈敏度上還是檢測效率上，都具有一定優勢，且檢測設備方便攜帶，能夠滿足現場快速檢測需求，是對現有檢測方法的有益補充。

　　目前對食品中RB的快速檢測方法報道較少，本研究基於時間分辨熒光標記技術和側流免疫層析技術，開發了RB的TRFICA法，可用於調味品中RB的快速定量檢測。本研究建立的方法操作簡單，待檢樣本經一步提取後即可通過試紙條實現對RB的檢測，結果可在17 min內獲得，其在辣椒粉、辣椒油和番茄醬中LOD分別為1.9、0.7、1.5 μg/kg，均低於現行標準檢測方法SN/T 2430—2010（LOD：5 μg/kg）。通過特異性實驗、添加回收實驗可知，本研究所構建方法具有良好的特異性、準確度和精密度。通過儀器確證實驗驗證了本方法的準確性和可靠性，表明本方法可用於調味品中RB的快速篩查。本研究初步探討了時間分辨熒光標記技術和側流免疫層析技術在RB檢測應用上的可行性，可為RB熒光定量試紙條的開發奠定基礎，但研究還存在著不同調味品類型標準曲線不統一、檢測靈敏度需進一步提高、設備智能化水平不高等問題，開展係統的樣品預處理方法研究，開發信號更強的標記物，探索機器學習和人工智能在檢測體係中的應用研究是解決上述問題的未來發展方向。

　　2009年7月至2014年8月在北京維德維康生物技術有限公司從事食品中有害物質快速檢測產品研發工作，2014-2018年在中國農業大學攻讀博士學位，2018年6月博士畢業並到棗莊學院工作，主要研究方向為食品中危害物快速檢測技術。 主持山東省重點研發計劃項目1 項，參與國家級和省市級科研課題多項，在Food Chemistry，Journal of Food Composition and Analysis，Food Analytical Methods等食品類專業期刊發表學術論文多篇，參與申請並獲授權專利１０餘項。

　　實習編輯：楊倩；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源於文章原文及攝圖網

　　為匯聚全球智慧共探產業變革方向，搭建跨學科、跨國界的協同創新平台，由北京食品科學研究院、中國肉類食品綜合研究中心、國家市場監督管理總局技術創新中心（動物替代蛋白）、中國食品雜誌社《食品科學》雜誌（EI收錄）、中國食品雜誌社《Food Science and Human Wellness》雜誌（SCI收錄）、中國食品雜誌社《Journal of Future Foods》雜誌（ESCI收錄）主辦，西南大學、 重慶市農業科學院、 重慶市農產品加工業技術創新聯盟、重慶工商大學、 重慶三峽科技大學 、西華大學、成都大學、四川旅遊學院、北京聯合大學、 中國-匈牙利食品科學“一帶一路”聯合實驗室（籌） 共同主辦 的“ 第三屆大食物觀·未來食品科技創新國際研討會 ”， 將於2026年4月25-26日 （4月24日全天報到） 在中國 重慶召開。

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